在生物體內膽甾醇從乙酰輔酶A生物合成。三分子乙酰CoA（C₂）縮合，經由乙酰乙酰CoA（C₄）而成為3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A，它的硫酯基被還原而生成甲羥戊酸（C₆）。由于甲羥戊酸的磷酸化和隨后發生的脫羧和脫水而生成異戊烯焦磷酸（C₅）和二甲基丙烯焦磷酸（C₅）。后二者，順次結合而生成牻牛兒醇焦磷酸（C₁₀）。繼而變成法尼焦磷酸（C₁₅），二分子法尼焦磷酸結合而成〔角〕鯊烯（squalene）（C₃₀），〔角〕鯊烯氧化性閉環成為羊毛甾醇（C₃₀）。最后，在羊毛甾醇的4和14位上的3個甲基脫掉，Δ²⁴的雙鍵飽和以及Δ⁸雙鍵向Δ⁶位移動而得到膽甾醇。結果膽甾醇的27個碳原子都是來自醋酸（15個來自醋酸的甲基碳素，12個來自羧基碳素）。幾乎所有的組織都可從醋酸合成膽甾醇。參與膽甾醇合成的酶都含于微粒體中，細胞的可溶性部分存在著促進因子，C₂₈及C₂₉甾體生物合成最初也經歷著和膽甾醇一樣的途徑，形成甾體核，以后，在側鏈24位上引入來自蛋氨酸甲基的碳原子。