(1) 目的基因組DNA片段的制備
基本原則：DNA片段之間存在部分重疊序列；DNA片段大小均一。
分離和純化真核生物基因組DNA時，通常采用蛋白酶分解和有機相抽提的方法除掉蛋白質及脂類等其他大分子。基因組DNA片段化則主要采用物理剪切法和限制性內切酶法。
(2)外源DNA片段的全克隆
選擇適宜的載體，與外源DNA片段相連。
常用的載體有質粒、噬菌體、粘粒（cosmid）以及YAC。這些載體可以克隆的DNA片段長度上限分別約為10、23、45和1000kb。選擇載體的主要參數是基因組大小，即基因組DNA序列的長短。
例如，構建大腸桿菌（4.6′ 106kb）等基因組較小生物的基因組文庫時，采用質粒作為載體便可得到滿意的結果：按每個DNA片段平均長5kb計算，一個包括5000個DNA片段克隆的基因文庫就能夠代表一個完整的大腸桿菌基因組序列。構建較大基因組的文庫時，噬菌體、粘粒以及YAC常被選作克隆載體。
通過轉化或轉導的方法將帶有不同DNA片段的重組DNA分子導入受體細胞，獲得一套包含特定生物體所有DNA序列的克隆。
(3)期望重組子的篩選
很多方法能幫助我們從基因文庫的眾多克隆中篩選和鑒定帶有特定基因的克隆，它們大多是以雜交探測技術（hybridization probing）為基礎的。
雜交探測是一種利用能和目的基因序列互補的DNA或RNA片段為探針，通過分子雜交的手段找出帶有目的基因的DNA片段的實驗方法。
用菌落（菌斑）原位雜交或免疫原位檢測法可快速篩選基因文庫。一般采用三步甚至兩步篩選法，可以在短時間內完成全基因文庫的篩選，其程序為：
首先制備高密度平板，使每塊平板密集分布5000-10000個菌落或噬菌班，進行原位雜交；
由感光膠片上的斑點位置在原雜交陽性平板的相應區域挖下固體瓊脂，用新鮮培養基洗滌稀釋；
將稀釋液再次涂布平板，使每塊平板只含有200-500個可辨認的菌落或菌斑；
用相同的探針進行二輪雜交，直至準確挑出期望的重組克隆。
