1 從37℃培養16～20h的新鮮平板中挑取一個單菌落（如大腸桿菌DH52），或1ml新鮮的16～20h過夜培養物，轉到一個含有100mlLB培養基的1L或500ml培養瓶中。
于37℃振搖培養約2～3h（旋轉搖床200～300r/min），每隔20～30min測量OD600值≈0.4。
2．在無菌條件下將細菌轉移到一個，用冰預冷的50ml聚丙烯離心管中，冰上放置10～20min；
3 于4℃4000轉 /分離心10min，回收細菌細胞；
4 將管倒置1min，以使最后殘留的痕量培養液流盡；
5 以10ml用冰預冷的0.1mMCaCl2重懸每份沉淀，放于冰上 ， 4℃4000轉 /分離心10min，回收細菌細胞；
6 每50ml初始培養物用2ml冰預冷的0.1M CaCl2重懸每份沉定，此時，可以迅速將細胞分裝成小份，液氮中冰凍，-70℃貯存備用。
7 用無菌吸頭從感受態細胞懸液中取200μl轉移到無菌的微量離心管中，加DNA或連接反應混合物（體積≤10μl，DNA≤50ng），輕旋以混勻內容物，冰浴30min；
8 將離心管放到預加溫到42℃的水浴中，90s；
9 將混合物快速轉移到冰浴中，冷卻1-2分鐘，加入適當的培養基在37 ℃培養45 分鐘，使細胞復蘇，并表達質粒所攜帶的轉化基因；
10 將適當體積（每個90mm平板可達200μl）已轉化的感受態細胞轉移到相應抗生素的平板培養基上。
11 將平板置于室溫至液體被吸收 ，倒置平板于37℃培養箱中，12～16h，平板培養，克隆在此期間應該出現，否則轉化不成功。