等密度離心分離樣品主要是根據被分離樣品的密度。在這種離心分離方法中，要用介質產生一種密度梯度， 這種密度梯度覆蓋了待分離物質的密度，這樣，通過離心使不同密度的顆粒懸浮到相應的介質密度區。在這種梯度離心中，顆粒的密度是影響最終位置的惟一因素，因此用這種方法分離顆粒，主要是根據被分離顆粒的密度差異。只要被分離顆粒間的密度差異大于1% 就可用此法分離。

蔗糖或者甘油(它們的最大密度是1.3g/cm3)通常可用于分離膜結合的細胞器，如高爾基體、內質網、溶酶體和線粒體。在等密度梯度離心中蔗糖或甘油的梯度的作用與移動區帶離心中梯度原理是不同的，在移動區帶離心中梯度的惟一目的是減少樣品的擴散， 即使是在離心管的底部，顆粒的密度也比介質大。相反，在等密度梯度離心中，使用的密度是足以阻止顆粒移動的密度，當顆粒達到與本身密度相同的密度區時就會停留在該區域。

離心分離密度大于1.3g/cm3的樣品，如DNA、RNA，需要使用密度比蔗糖和甘油大的介質。重金屬鹽氯化銫(CsCl)是目前使用的最好的離心介質，它在離心場中可自行調節形成濃度梯度，并能保持穩定。在氯化銫形成的密度梯度中，離心管頂部的密度為:1.65g/cm3，底部為:1.75g/ cm3。因為DNA的密度是1.70g/ cm3，會停留在離心管的中部。