這一方法需要用蔗糖或甘油制備輕微的連續密度，然后將待分離的樣品加在離心管的最上層，形成一狹窄的帶，再通過較長時間的離心。在離心過程中，大小、形狀、密度不同的顆粒就會分開，最后收集各區帶得到要分離的物質。在此方法中，分離介質對被分離的物質必須是中性無害的，并且密度梯度較低，底部的密度比管頂部的密度大，建立密度梯度的目的是防止擴散。重要的是，待分離顆粒的密度比離心管中任何部分介質的密度都要大。常用的是蔗糖密度梯度離心(sucrose density gradient centrifugation)。