在ELISA的研發(fā)制備中尤為重要的就是它的指控流程，包括抗原設(shè)計(jì)及制備篩選，抗體制備，標(biāo)準(zhǔn)品的定量，檢測(cè)液的優(yōu)化，試劑盒的組裝，以及各種性能的驗(yàn)證。對(duì)于科研工作者來(lái)說(shuō)，要制備一個(gè)好的ELISA kit，需要具備敏感性高，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好，并且其試劑穩(wěn)定、易保存，操作簡(jiǎn)便等。下面來(lái)看一下ELISA的質(zhì)控控制。

1. 抗原抗體選擇

ELISA檢測(cè)原理基于抗原抗體反應(yīng)，其質(zhì)量影響了試劑盒的性能。對(duì)于大分子蛋白抗原，多采用雙抗體夾心法，使用優(yōu)的抗體對(duì)，且至少有一種為單抗，配對(duì)篩選最佳信噪比的包被和檢測(cè)抗體。對(duì)于抗原為多肽和小分子（或者偶聯(lián)物），多采用競(jìng)爭(zhēng)抑制法，抗體的是經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的單克隆抗體或者多克隆抗體。

2. 標(biāo)準(zhǔn)品

對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)品定量的準(zhǔn)確性，每個(gè)公司對(duì)于定量標(biāo)準(zhǔn)和方法可能會(huì)有不同，這是企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。試劑盒使用的標(biāo)準(zhǔn)品多為重組蛋白或者單價(jià)的小分子， 定量可參考國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)信息網(wǎng)或者一些大公司，如R&D， Abcam等。標(biāo)準(zhǔn)品的定量直接會(huì)決定試劑盒最后樣本的檢測(cè)結(jié)果。

3. 天然樣本驗(yàn)證分析

我們?cè)谶x擇樣本時(shí)，避免使用有外源性污染的樣本，避免血樣本出現(xiàn)溶血、細(xì)菌污染，最好使用較新鮮樣本，避免反復(fù)凍融。
血清是最為常見(jiàn)的檢測(cè)樣本，但是大約40%的血清標(biāo)本中含有非特異性干擾物質(zhì)，可以不同程度影響檢測(cè)結(jié)果；常見(jiàn)的干擾物質(zhì)有：類風(fēng)濕因子RF、補(bǔ)體、交叉反應(yīng)物質(zhì)和異嗜性抗體等其他物質(zhì)等。避免其發(fā)生的方法有：

①標(biāo)本用聯(lián)有熱變性IgG的固相吸附劑處理。

②用2-C₂H₆OS加入到標(biāo)本稀釋液中使RF降解。

③56℃ 30 min加熱血清使補(bǔ)體滅活。

在樣本檢測(cè)中，稀釋對(duì)于實(shí)驗(yàn)的成功也至關(guān)重要，稀釋過(guò)度以及稀釋不足均有可能導(dǎo)致樣本的測(cè)值低。Elisa 實(shí)驗(yàn)較為常見(jiàn)的一個(gè)現(xiàn)象就是鉤狀效應(yīng)，即抗原與抗體比例不合適而導(dǎo)致假陰性的現(xiàn)象，抗原過(guò)量稱為后帶效應(yīng)。當(dāng)樣本中目標(biāo)物含量很高，而沒(méi)有進(jìn)行正確的稀釋，就有可能會(huì)導(dǎo)致假陰性反應(yīng)。