3、提高逆轉錄保溫溫度
較高的保溫溫度有助于RNA二結構的打開，增加了反應的產量。對于多數RNA模板，在沒有緩沖液或鹽的條件下，將RNA和引物在65℃保溫，然后迅速置于冰上冷卻，可以消除大多數二結構，從而使引物可以結合。

4、促進逆轉錄的添加劑
包括甘油和DMSO在內的添加劑加到*鏈合成反應中，可以減低核酸雙鏈的穩定并解開RNA二結構，多可以加入20％的甘油或10％的DMSO而不影響SuperScriptⅡ或M-MLV的活性。AMV也可以耐受多20％的甘油而不降低活性。

5、RNaseH處理
在PCR之使用RNaseH處理cDNA合成反應可以提高靈敏度。對于某些模板，在cDNA合成反應中的RNA會阻止擴增產物的結合，在這種情況下，RNaseH處理可以增加靈敏度。一般當擴增較長的全長cDNA目標模板時，RNaseH處理是必需的，比如低拷貝的tuberous scherosisⅡ。對這種困難模板，RNaseH的處理加強了SuperScriptⅡ或AMV合成的cDNA所產生的信號。對于多數RT-PCR反應，RNaseH處理是可選的，因為95℃保溫的PCR變性步驟一般會將RNA：DNA復合物中的RNA水解掉。