一、提取抗原蛋白
將提取RNA途中留存的樣品，加入150μl 100%酒精充分混勻，靜置5min(RT), 2000×g , 4℃離心5min, 吸取上清至新管中, 加入750μl異丙醇, 混勻, 靜置10min(RT), 12000×g, 4℃離心10min, 棄上清, 加入1ml 0.3mol/L鹽酸胍/95%酒精重懸沉淀, 用加樣器打散沉淀, 混旋20~30秒, 靜置20min(RT) , 7500×g, 4℃離心5min, 棄上清 , 重新加入1ml 0.3mol/L鹽酸胍/95%酒精兩次, 重懸沉淀, 離心后棄上清, 加入100% 無水乙醇 1ml, 混旋1min, 靜置20min(RT), 7500×g, 4℃離心5min, 棄上清,真空干燥5min , 50μl 1%SDS溶解沉淀，用50℃熱水助溶，直至全部溶解。10000×g, 離心10min,去除沉渣。
二、蛋白定量
1. 取PBS、各樣品10 ul，加DW 990 ul
2. 取DW勻漿緩沖液、樣品稀釋液、系列牛血清白蛋白標準濃度0.5 ml。
3. 向各管加入2.5 ml D試劑（A50ml＋B0.5ml＋C0.5ml A－2%[陳星云1] Na2CO3、0.1N NaOH，B－0.5%CuSO4，C－1%酒石酸鈉）混勻，靜置10分鐘。
4. 迅速加入酚試劑0.25ml，混勻 37℃ 水浴30分鐘。
5. 721分光光度計650 nm，比色，S0標準管調零。
6. 最后稀釋為4 ug /ul，加載樣緩沖液后，終濃度為2ug / ul，上樣量為30～80ug / 泳道。
三、電泳
1. make gel．
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11%分離膠 12ml 兩塊膠 |
4%積層膠6ml兩塊膠 |
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DW 4.36 ml |
DW 堵漏 3.66ml |
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3M Tris 3.0 ml |
0.5M Tris 1.5 ml |
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30%Arc 4.4 ml |
30%Arc 0.5 ml 0.78 ml |
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10%SDS 0.24 ml |
10%SDS 60 ul |
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10%APS 0.12 ml |
10%APS 20ul 30 ul |
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TEMED 10ul |
TEMED 5ul 6ul |
2. 上樣前樣品處理：
樣品100℃、3分鐘、冷卻，900×g、離心30 S。
3. 通電電： 積層膠電泳電壓50V左右，分離膠電泳電壓90～110V。
4. 考馬斯亮藍染色： 1小時，1號脫色1小時，2號脫色2小時。
四、電轉印
1. 將濾紙NcM切成與凝膠尺寸大小，置于DM中浸透5分鐘，電轉液平衡15分鐘。
2. 轉移：用二張大濾紙貼于兩張多孔墊料，將NcM、膠夾于中間，在NcM與大濾紙之間墊小濾紙。NcM朝正極，20V恒壓轉移12小時。取下NcM雜交，凝膠染色看效果。
五、雜交
1. 取下NcM，做好標記，dH2O沖洗，室溫濾紙干或放入膜固定液15分鐘。
2. NcM用PBS沖洗二遍，呈5～6% non－fat milk的pH7.2的PBS中封閉，室溫 ６－８小時或室溫1－2小時，4℃，過夜。
3. 將封閉的膜用ＰＢＳ沖洗一遍，洗15分鐘×1，5分鐘×2。
4. 加入一抗 1:1000－1200，室溫，反應1小時
5. PBS洗15分鐘×1，15分鐘×4。
6. 加入二抗 1:5000，室溫，反應1小時。
7. PBS洗15分鐘×1，5分鐘×4。
六、化學發光試劑檢測
1. 混合等體積Bottle1&2與NcM共孵育1分鐘。
2. 放射自顯影：曝光3分鐘至10分鐘。
3. 顯影后清水漂洗，再定影。
七、所用試劑
1、勻漿緩沖液 4×1L：
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NaH2PO4（·H2O） |
12.48g |
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Na2PO4·12H2O |
114.6g |
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NaCl |
3.6g |
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dw 800ml, adjust pH to 7.0, adjust Vol to 1 L |
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（1）用時稀釋4倍。
（2）40ml PBS＋PMSF 40 ul＋1.10 phenautehroline 80 ul＋Iodo 80ul＋pepstalmA 80ul
2. 系列牛血清蛋白濃度稀釋法：
取500ug / ml BSA按下法配制：
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500ug / ml BSA |
NS |
蛋白濃度ug / ml |
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S1 |
50 ul |
1.95 ml |
12.5 |
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S2 |
100 ul |
1.90 ml |
25 |
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S3 |
200 ul |
1.80 ml |
50 |
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S4 |
400 ul |
1.60 ml |
100 |
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S5 |
800 ul |
1.20 ml |
200 |
3. 30瑀ylamide
29.2g單丙、0.8g雙丙溶解于60 mlDDW，調Vol到100 ml
4. 3M Tris－Hcl buffer pH 8.9 100ml.
稱Tris 36.3g溶于水到100 ml，調pH到8.9
5. 0.5 M Tris－Hcl buffer pH 6.7 100ml
稱Tris5.98g溶解后，調pH到6.7，調體積到100ml
6. Samples buffer 10ml
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10%SDS |
2 ml |
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甘油 |
1 ml |
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0.5M Tris |
1.6 ml |
用前按9 : 0.5 : 加0.1溴酚蘭、0.5% DTT貯備液。 |
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DDW |
5.2 ml |
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7. 電轉液 1L pH 8.2－8.3
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Glycine |
14.42 g |
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Tris base |
3.02 g |
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dH2O |
800 ml |
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Methanol |
200 ml |
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10% SDS |
2 ml |
8. pH 7.2 PBS 2 L
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NaCl |
18.0g |
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KCl |
0.44g |
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Na2HPO4 |
2.84g（7.16g） |
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NaH2PO4 |
0.432g（0.562g） |
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加DW到2 L |
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9. 10×電極緩沖液 400 ml pH 8.4
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Tris base |
12.2 g |
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甘氨酸 |
57.76 g |
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加DW 400 ml, 調pH8.4，用前加SDS0.1% |
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10. 脫色液1號
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甲醇 |
250 ml |
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冰醋酸 |
50 ml |
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＋DW到500 ml |
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11. 脫色液2號
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甲醇 |
100 ml |
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冰醋酸 |
75 ml |
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＋DW到1000 ml |
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