限制性內切酶（restriction endonuclease）也稱限制性酶（restriction enzyme），是由W. Arber，H. Smith和D. Nathans等人（1979年）從細菌中分離的一類酶。限制酶具有極高的專一性，識別雙鏈DNA上特定的位點，將兩條鏈都切斷，形成粘末端或平末端。限制酶可以用來解剖纖細的DNA分子，在分析染色體結構、制作DNA的限制酶譜、測定較長的DNA序列、基因的分離、基因的體外重組等研究中是不可缺少的工具。對于研究DNA的分子生物學家來說，這是一把天賜神刀——分子生物刀。

限制性酶的生物學功能在于防御或“限制”入侵細胞的外DNA（如噬菌體DNA）。原核生物利用他們獨特的限制性內切酶把外來DNA切成無感染性的片段。但不能降解自身細胞中的染色體DNA，因為細胞內還有“共座”的DNA甲基化酶修飾相應序列使之受到保護。

限制酶可被分成三種類型。I型和Ⅲ型限制酶水解DNA需要消耗ATP，全酶中的部分亞基有通過在特殊堿基上補加甲基基團對DNA進行化學修飾的活性。I型限制性內切酶在隨機位點切割DNA；Ⅲ型限制酶識別雙鏈DNA的特異核苷酸序列，并在這個位點內或附近切開DNA雙鏈。

Ⅱ型限制性內切酶已被廣泛應用于DNA分子的克隆和序列分析，這是因為它們水解DNA不需要ATP，并且也不以甲基化或其他方式修飾DNA。最重要的是它們在它們所識別的特殊核苷酸順序內或附近切割DNA鏈。這些特殊序列常常含4個或6個核苷酸殘基，通常具回文結構（palindromic structure），切割后形成粘末端（或平末端）。例如，大腸桿菌的一限制酶稱EcoR I，它識別下列六核苷酸順序：

5'……GAATTC……3'

3'……CTTAAC……5'

這種回文結構的兩條鏈以5'→3'方向閱讀序列都是一樣的結構，當EcoR I遇到DNA的這種序列時，它會對這種DNA鏈進行交錯切割，產生突出的5'末端。

5'……G AATTC……3'

3'……CTTAA C……5'

有些限制酶，如Pst I，它識別序列5'-CTGCAG-3'，并在A與G之間切割DNA雙鏈產生3'突出粘性末端。還有些限制酶，如Bal I，DNA鏈產生具有平末端（blunt end）的DNA片段。

限制酶的命名較為特殊。以EcoR I為例加以說明。第一個大寫字母E為大腸桿菌E. coil的屬名的第一個字母，第二、三兩個小寫字母co為它的種名的頭兩個字母。第四個字母用大寫R，表示所用大腸桿菌的菌株。最后一個羅馬字表示從該細菌中分離出來的這一類酶的編號。目前提純的限制酶已很多，常用的約有100多種，并且已轉化成為商品。大大節約了研究人員的時間。