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蛋白質(zhì)組研究技術(shù)

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-06-28

1 雙相電泳(2-D PAGE)——蛋白質(zhì)分離技術(shù)

  雙相電泳由O'Farrell于1975年首先創(chuàng)建。雖然并不是一項新技術(shù),其仍成為目前獲得蛋白質(zhì)圖譜的最主要手段。基本原理是蛋白質(zhì)首先于第一相根據(jù)其等電點在pH梯度膠中等電聚焦(isoelectric focusing or IEF),然后在第二相按照各蛋白質(zhì)的分子量大小(SDS-PAGE)進(jìn)行第二次電泳分離。與一維的IEF或SDS-PAGE相比,雙相電泳具有更高的分辨率,其可以分辨3000多種蛋白質(zhì)。

  傳統(tǒng)雙相電泳根據(jù)低分子量的氨基酸具有不同的等電點,采用兩性電解質(zhì)作為載體,在外加電場下產(chǎn)生pH梯度;而新的穩(wěn)定pH膠(immobilized pH gel,IPG)技術(shù)則利用丙烯酰胺的酸堿衍生物可以在膠聚合的過程□價結(jié)合于聚丙烯酰胺基質(zhì)的特點,產(chǎn)生穩(wěn)定的pH梯度。

  樣品在系統(tǒng)中的溶解性與最終的分辨結(jié)果密切相關(guān)。目前,許多改進(jìn)雙相電泳的研究都著眼于增加蛋白的溶解度。

2 質(zhì)譜(Mass spectrometry,MS)——蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)

  質(zhì)譜已成為將蛋白質(zhì)與其基因聯(lián)系起來的重要工具,廣泛用于蛋白質(zhì)組的研究中,其基本原理是使極性或帶電的分子產(chǎn)生氣相離子,根據(jù)不同離子間的質(zhì)荷比(m/z)來分離并確定分子量。離子化技術(shù)的提高使質(zhì)譜技術(shù)得到了進(jìn)一步發(fā)展。快速原子轟擊(FAB)可以使雙分子物質(zhì)離子化,電噴霧離子化(ESI)和基質(zhì)輔助的激光解吸離子化(MALDI)是更新的“軟離子化法”,它們被應(yīng)用于多肽和蛋白質(zhì)的離子化。

  將化學(xué)和酶學(xué)的方法與質(zhì)譜相結(jié)合,可以獲得由不完整的短肽所組成的序列梯度,以測定核酸序列。如用羥肽酶Y降解產(chǎn)生截去C末端殘基的短肽,然后使用FAB或MALDI/TOF(time-of-fight)離子化;我們還可以通過將已知序列蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)庫中的質(zhì)荷比與實驗測得的結(jié)果進(jìn)行比較,從而推出待測序列。

  與傳統(tǒng)的Edman降解法,Western印跡分析相比,質(zhì)譜分析更為靈敏、精確、經(jīng)濟(jì),簡便。

3 蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(proteomic database)——生物信息學(xué)

  生物信息學(xué)(bioinformatics)使用計算機(jī)技術(shù)儲存和分析生物學(xué)信息,由此建立的基因組數(shù)據(jù)庫加速了分子生物學(xué)的進(jìn)展。蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫將是生物信息學(xué)的新領(lǐng)域。

  目前,雙相電泳結(jié)果可以采用電荷耦合器件——照相系統(tǒng)或掃描成像,再使用計算機(jī)輔助的影像分析和數(shù)據(jù)分析,解釋電泳結(jié)果。最早的雙相電泳膠數(shù)據(jù)庫建立于1992年,其站點名稱為SWISS-2DPAGE。自此,更多的數(shù)據(jù)庫(主要為21種),及含有質(zhì)譜分析軟件的程序庫都可以在互聯(lián)網(wǎng)上獲得。

 
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