原理

轉移電泳是將經聚丙烯酰胺凝膠電泳分離出的蛋白質譜直接轉移到硝酸纖維膜上，而形成固定相，并同時排除各種干擾物質，保持其天然構象和生物學活性，完成在凝膠中難以進行的各種生物試驗。

材料

1．瓊脂糖

2．丙烯酰胺

3．甲叉雙丙烯酰胺

4．十二烷基磺酸鈉（SDS）

5．硝酸纖維膜濾紙 孔徑0.45μm

6．瓊脂糖凝膠電泳緩沖液 0.89mMol/L Tris—89mmol/L 硼酸—2.5mMol/L EDTA（pH8.3）。

7．SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳緩沖液 0.05Mol/L Tris—0.384Mol/L 甘氨酸—0.1％SDS（pH8.3）。

8．蛋白質轉移電泳緩沖液 25mMol/L Tris—192mMol/L 甘氨酸—20％甲醇（pH8.3）。

9．溴乙啶溶液 稱取5mg溴乙啶，用無離子水溶解。定容到10ml，取1ml稀釋到1 000ml，最終濃度為0.5ug/ml。

10．考馬斯亮蘭R－250染色液 0.25％考馬斯亮蘭R－250－10％醋酸－45％甲醇。

11．氨基黑染色液 在含10％醋酸的甲醇中加入氨基黑10B至飽和。

12．垂直板型及水平板型凝膠電泳槽

13．轉移電泳槽

14．直流穩壓電源0V~800V，0mA~100mA

操作方法

1．SDS—聚丙稀酰胺凝膠電泳（垂直板型）分離蛋白質。

⑴凝膠的制備：

丙烯酰胺 15.00g

甲叉雙丙烯酰胺 0.40g

0.37Mol/L Tris—HCl（pH8.3） 50ml

此為丙烯酰胺母液，過濾后4℃保存備用。

丙烯酰胺母液 8.30ml

N、N、N、N—四甲基乙二胺（DEMED） 250ul

10％SDS 0.25ml

0.375Mol/L pH8.8 Tris－HCl 16.45ml

混合即為10％分離膠。

丙烯酰胺母液 1.30ml

TEMED 15.00ul

10％SDS 0.10ml

0.125Mol/L pH6.8Tris－HCl 8.60ml

制成4％濃縮膠。

將分離膠與濃縮膠真空抽氣10min~15min，備用。

⑵凝膠板的制備及加樣：取1％的瓊脂將凝膠膜底部的縫隙封固。在10％的分離膠中加入10％過硫酸銨0.25ml，混勻后，立即沿玻璃壁緩緩加入膠膜中，上端留出5cm的高度，然后用帶有細針頭的注射器輕輕地向膠面加入蒸餾水，靜置數分鐘，水膠界面消失，約20min～30min界面清晰（凝膠已聚合），用注射器將水吸出，并用濾紙吸干余水。在4％濃縮膠中加入10％過硫酸銨0.4ml，混勻后，沿玻璃壁緩慢倒入已聚合的分離膠的上面，立即插進樣品槽模板。待凝膠聚合后（約20min～30min），輕輕拔出樣品槽模板。將電泳緩沖液加入上、下電泳槽。

將分離的蛋白質樣品用0.01Mol/L Tris－HCl（pH8.0）－0.001Mol/L EDTA－1％SDS－5％硫基乙醇溶液作1︰1稀釋，100℃加熱處理3min之后，加入甘油10％及適當量溴酚蘭，用微量注射器將樣品注入樣品槽中，蛋白質最后濃度一般為0.05mg／ml～1mg／ml。

⑶電泳：上端接陰極，下端接陽極。電壓120V、電流30mA，電泳時間5h~6h，待染料泳至距底部約1cm處時斷電。

⑷染色：切下一部分凝膠，用考馬斯亮蘭R－250染色作為對照。其余部分作轉移電泳。