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高效液相色譜儀分析中保留時間不重現(xiàn)有保留時間漂移和保留時間波動兩種情況。前者是指保留時間僅沿單方向發(fā)生變化，后者指保留時間無固定規(guī)律的波動。保留時間漂移的原因有色譜柱平衡、固定相流失、色譜柱污染、流動相組成變化、流動相污染和疏水坍塌等。事實(shí)上，保留時間漂移往往是由色譜柱老化引起的。
一、色譜柱平衡：
高效液相色譜中保留時間發(fā)生漂移，首先應(yīng)考慮色譜柱是否已用流動相完全平衡。通常平衡需要10～20倍柱體積的流動相，但如果在流動相中加入少量添加劑（如離子對試劑），則需要相當(dāng)長的時間平衡色譜柱。
二、固定相流失：
固定相的穩(wěn)定性都是有限的，即使在推薦的pH值范圍內(nèi)使用，固定相也會慢慢水解。例如硅膠基質(zhì)在pH = 4時水解穩(wěn)定性最好。
固定相水解速度與流動相類型和配體有關(guān)。雙官能團(tuán)配體和三官能團(tuán)配體比單官能團(tuán)配體的鍵合相穩(wěn)定，長鏈鍵合相比短鏈鍵合相穩(wěn)定，烷基鍵合相比氰基鍵合相穩(wěn)定的多。
經(jīng)常清洗色譜柱也會加速固定相水解。
三、色譜柱污染：
高效液相色譜柱是非常有效的吸附性過濾器，它可以過濾并吸附流動相攜帶的任何物質(zhì)。污染源可以是流動相本身、流動相容器、連接管、泵、進(jìn)樣器、密封墊和樣品等。通常通過實(shí)驗(yàn)可判斷污染來源。
如果樣品中有在色譜柱上保留很強(qiáng)的組分，這些組分可能是使保留時間漂移的潛在根源，根源通常是樣品基質(zhì)，可以通過固相萃取等樣品前處理除去樣品基質(zhì)。通常樣品中強(qiáng)保留組分的分子量較高，保留時間漂移的同時或其后，反壓會增加。
一、色譜柱平衡：
高效液相色譜中保留時間發(fā)生漂移，首先應(yīng)考慮色譜柱是否已用流動相完全平衡。通常平衡需要10～20倍柱體積的流動相，但如果在流動相中加入少量添加劑（如離子對試劑），則需要相當(dāng)長的時間平衡色譜柱。
二、固定相流失：
固定相的穩(wěn)定性都是有限的，即使在推薦的pH值范圍內(nèi)使用，固定相也會慢慢水解。例如硅膠基質(zhì)在pH = 4時水解穩(wěn)定性最好。
固定相水解速度與流動相類型和配體有關(guān)。雙官能團(tuán)配體和三官能團(tuán)配體比單官能團(tuán)配體的鍵合相穩(wěn)定，長鏈鍵合相比短鏈鍵合相穩(wěn)定，烷基鍵合相比氰基鍵合相穩(wěn)定的多。
經(jīng)常清洗色譜柱也會加速固定相水解。
三、色譜柱污染：
高效液相色譜柱是非常有效的吸附性過濾器，它可以過濾并吸附流動相攜帶的任何物質(zhì)。污染源可以是流動相本身、流動相容器、連接管、泵、進(jìn)樣器、密封墊和樣品等。通常通過實(shí)驗(yàn)可判斷污染來源。
如果樣品中有在色譜柱上保留很強(qiáng)的組分，這些組分可能是使保留時間漂移的潛在根源，根源通常是樣品基質(zhì)，可以通過固相萃取等樣品前處理除去樣品基質(zhì)。通常樣品中強(qiáng)保留組分的分子量較高，保留時間漂移的同時或其后，反壓會增加。
四、流動相組成變化：
流動相組成的緩慢變化也是保留時間漂移的常見原因，如流動相中易揮發(fā)組分的揮發(fā)和循環(huán)使用流動相等。
五、流動相污染：
溶于流動相中的少量污染物可能慢慢富集到色譜柱上，從而造成保留時間漂移。
注意：水是很容易污染的流動相成分。
六、疏水坍塌：
當(dāng)小孔徑和端基封口良好的反相色譜柱使用接近100%的水為流動相時，有時會發(fā)生分離突然喪失、樣品保留明顯降低或完全不保留，此現(xiàn)象稱為疏水坍塌。
