微生物組測序--環境類樣本取樣方法

1.土壤

1.1 普通土壤

取樣容器：1.5-50ml離心管

送樣量：擴增子重量≥2g；宏基因組重量≥5g；

1）根據研究設計選擇具有代表性的土壤；

2）采樣所用工具、塑料袋或其他物品都要事先滅菌，或用采取的土壤擦拭；

3）取 5-10cm處土壤，多點采取重量相當的土壤進行混勻，去除雜質后再取一定量土壤裝入無菌管，每個樣品取樣2-10g；

4）密封后用大體積干冰運輸，且要保證我方在收到樣品開箱檢驗時有足夠的干冰剩余。

注意事項：為防止交叉污染，不建議使用自封袋取樣。

1.2 根際土壤

取樣容器：1.5ml-50ml離心管

送樣量：擴增子重量≥2g；宏基因組重量≥5g；

1）使用的工器具要事先消毒滅菌處理；

2）采集20cm深的根際土壤于50mL的無菌管里，迅速放在液氮里凍存；

3）用20目的篩子過篩，去除植物根、動物殘骸以及其他雜質后分裝到無菌離心管里，每管3~5g，密封后立即-80℃儲存備用。

2. 植物組織

送樣量：擴增子重量≥1g；宏基因組重量≥2g；

1）大田或野外獲取的材料；

2）取材后需用70%酒精將材料表面的灰塵及泥土沖洗干凈，吸干；

3）液氮速凍后，放入預冷的50ml離心管或是封口袋中，用大體積干冰運輸。

注意事項：優先選用新鮮采集的樣品送樣；根，莖，果實組織較大時，切碎后送樣。

3. 植物根表面

取樣容器：1.5-50ml離心管

1）將所研究的物體放在事先滅好的無菌容器當中；

2）加入PBS緩沖液后進行振蕩，使得微生物從物體表面充分的脫落并聚集在PBS緩沖液當中,震蕩至少2h以上；

3）直接提取PBS緩沖液中的微生物或者將緩沖液用濾膜過濾之后再進行DNA的提取。

PBS濃度和PH有要求：濃度是用1x的，PH值是7.4的，一般買回來的PBS是10x的，我們會稀釋到1x。

注意事項：建議優先使用超聲波洗滌。

4. 植物內生菌

送樣量：擴增子干重≥1g；宏基因組干重≥2g；

1）根據研究目的選取對應的新鮮植物組織；

2）依次用70%無水乙醇浸泡40s，再用2.5%次氯酸鈉浸泡10min，每100ml 2.5%次氯酸鈉加一滴吐溫80；

3）無菌水清洗2-3次，-80℃保存。

5. 水體

取樣容器：1.5-50ml離心管

送樣量：擴增子直徑3-4cm濾膜1-2張；宏基因組直徑3-4cm濾膜1-2張；

1）研究目的進行確定水體的取樣深度和范圍；

2）采樣后進行濾膜過濾，選擇合適孔徑的濾膜，對于澄清水體或者略渾濁水體，選用0.22μm或者0.45μm的濾膜，取樣體積大于5L；對于渾濁水體，建議先用大孔徑的濾膜過濾一遍，再用小孔徑的濾膜過濾；

3）水體泥樣的采集提供大于5g樣本；

4）用大體積干冰運輸，且要保證我方在收到樣品開箱檢驗時有足夠的干冰剩余。

注意事項：擴增子項目將3-5L水體過濾到1-2張濾膜（0.22或0.45um）后裝入到離心管中；宏基因組項目將30-50L水體過濾到1-2張濾膜（0.22或0.45um）后裝入到離心管中。

6. 污泥、海洋沉積樣本

1）活性污泥樣本取自活性污泥裝置中，一般取樣量大于20ml，將其置于無菌管中，建議立即提取后-80℃保存；

2）海洋沉積樣本根據研究目的進行取樣，一般建議取1kg以上的沉積物裝入塑料袋中，低溫運輸并盡快進行提取-80℃保存。

注意：活性污泥樣本等一般建議及時提取，樣本體積較大，長時間-80℃保存，一方面儲存不便，另一方面凍融提取也比較困難，加大了實驗工作量及難度。建議提取后保存DNA即可。

7. 空氣

1）抽取針對實驗目的的空氣微顆粒，用不同孔徑大小的無菌濾膜篩選目的顆粒（將含顆粒過濾膜裝入無菌鋁箔內，密封在-80℃長期保存）；

2）截取適量大小過濾膜，置于含有1xPBS 緩沖液的50ml離心管；在4℃條件下，加速度離心2h；

3）溫和旋渦處理，0.2μm的Supor 200 PES Membrance Disc Filter 過濾紙重懸液。

注意：由于樣本特殊，微生物含量較少，建議多保管備份保存。